Quantitative Bestimmung der Wirksamkeit von Stoffen zur Desinfektion in der Trinkwasseraufbereitung
Stand 2010
Leseprobe
Vorwort :
Das vorliegende Prüfverfahren wurde am Umweltbundesamt im Fachgebiet Trinkwasserressourcen und Wasseraufbereitung (FG II 3.3) in Zusammenarbeit mit dem Fachgebiet „Mikrobiologische Risiken (FG II 1.4) entwickelt. Das Verfahren ist der Trinkwasserkommission des Bundesministeriums für Gesundheit und dem zuständigen Arbeitskreis der Deutschen Vereinigung des Gas- und Wasserfaches e.V. vorgestellt worden. Beide Fachgruppen haben das vorliegende Prüfverfahren im Grundsatz akzeptiert.
Einleitung
Diese Prüfvorschrift beschreibt ein Simulationsverfahren zur Feststellung, ob ein Desinfektionsmittel, das für die in Abschnitt 1 beschriebenen Bereiche vorgeschlagen wurde, eine ausreichende bakterizide und viruzide Wirkung aufweist. Dieses Verfahren wird als Laborversuch an einer halbtechnischen Anlage durchgeführt und simuliert praxisnahe Anwendungsbedingungen.
Die gewählten Bedingungen spiegeln Parameter wieder, wie sie in der Praxis vorkommen. Liegt eine ausreichende Wirksamkeit vor, kann die geprüfte Konzentration des Desinfektionsmittels als ausreichend wirksame Konzentration bezeichnet werden.
Jede ausreichend wirksame Konzentration, die aus dieser Prüfung resultiert, gilt streng genommen nur für die festgelegten experimentellen Bedingungen. Sie legt die generelle Eignung des Desinfektionsmittels zum Einsatz für die Trinkwasserdesinfektion fest.
Eine Prüfung der Wirksamkeit unter allen in der Praxis vorkommenden Bedingungen ist nicht Ziel dieser Wirksamkeitsprüfung. Im praktischen Einsatz kann daher in Abhängigkeit von Indikation, Einsatzbedingungen und gesetzlichen Regelungen von der ausreichend wirksamen Konzentration abgewichen werden, um die Wirksamkeit sicher zu stellen.
1 Anwendungsbereich
Dieses Prüfverfahren legt Mindestanforderungen für die ausreichende bakterizide und viruzide Wirkung von Desinfektionsmitteln fest, die dem Wasser zur Trinkwassergewinnung oder dem Trinkwasser im Verteilungsnetz zugeführt werden. Die Bestimmung einer bakteriziden oder viruziden Wirkung eines Desinfektionsmittels ist nur möglich, wenn der Stoff mit angemessenem Aufwand quantitativ messbar ist und sich seine Wirkung innerhalb kurzer Zeit neutralisieren (inhibieren) lässt (Anhang C). Unter besonderen Bedingungen (siehe 5.7) können zusätzliche Prüfbedingungen benötigt werden, um eine abschließende Schlussfolgerung ziehen zu können.
2 Normative Verweisungen
Diese Prüfvorschrift enthält durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderen Publikationen. Diese normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationen sind nachstehend aufgeführt. Bei datierten Verweisungen gehören spätere Änderungen oder Überarbeitungen dieser Publikationen nur zu dieser Prüfvorschrift, falls sie durch Änderung oder Überarbeitung eingearbeitet sind. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publikationen.
DIN EN ISO 7899-1.
Wasserbeschaffenheit - Nachweis und Zählung von intestinalen Enterokokken - Teil 1: Miniaturisiertes Verfahren durch Animpfen in Flüssigmedium (MPN-Verfahren) (ISO 7899- 1:1998); Deutsche Fassung EN ISO 7899-1:1998 2010-01 (D) Seite 3 DIN EN ISO 7899-2.
Wasserbeschaffenheit - Nachweis und Zählung von intestinalen Enterokokken - Teil 2: Verfahren durch Membranfiltration (ISO 7899-2:2000); Deutsche Fassung EN ISO 7899- 2:2000 DIN EN ISO 9308-1 Wasserbeschaffenheit - Nachweis und Zählung von Escherichia coli und coliformen Bakterien - Teil 1: Membranfiltrationsverfahren (ISO 9308-1:2000); Deutsche Fassung EN ISO 9308-1:2000 DIN EN ISO 9308-3
Wasserbeschaffenheit - Nachweis und Zählung von Escherichia coli und coliformen Bakterien in Oberflächen- und Abwasser - Teil 3: Miniaturisiertes Verfahren zum Nachweis von E. coli (ISO 9308-3:1998); Deutsche Fassung EN ISO 9308-3:1998 DIN EN ISO 8199
Wasserbeschaffenheit - Allgemeine Anleitung zur Zählung von Mikroorganismen durch Kulturverfahren (ISO 8199:2005); Deutsche Fassung EN ISO 8199:2007 DIN EN 12671 Produkte zur Aufbereitung von Wasser für den menschlichen Gebrauch- Vor Ort erzeugtes Chlordioxid; Deutsche Fassung EN 12671:2009. DIN EN ISO 7393-2
Wasserbeschaffenheit - Bestimmung von freiem Chlor und Gesamtchlor - Teil 2: Kolorimetrisches Verfahren mit N,N-Diethyl-1,4-Phenylendiamin für Routinekontrollen (ISO 7393-2:1985); Deutsche Fassung EN ISO 7393-2:2000. DIN EN ISO 10705-1
Wasserbeschaffenheit - Nachweis und Zählung von Bakteriophagen - Teil 1: Zählung von F-spezifischen RNA-Bakteriophagen (ISO 10705-1:1995); Deutsche Fassung EN ISO 10705-1:2001 DIN EN ISO 10705-2
Wasserbeschaffenheit - Nachweis und Zählung von Bakteriophagen - Teil 2: Zählung von somatischen Coliphagen (ISO 10705-2:2000); Deutsche Fassung EN ISO 10705- 2:2001 Richtlinie 98/8/EG des Europäischen Parlamentes und des Rates vom 16. Februar 1998 über das Inverkehrbringen von Biozid-Produkten (Biozidrichtlinie)
3 Begriffsbestimmungen Für die Anwendung in dieser Prüfvorschrift gelten folgende Begriffsbestimmungen. 3.1 Produkt Es gilt die Definition von Biozid-Produkten gemäß Biozidrichtlinie: „Wirkstoffe und Zubereitungen, die einen oder mehrere Wirkstoffe enthalten, in der Form in welcher sie zum Verwender gelangen, und die dazu bestimmt sind, auf chemischem oder biologischem Wege Schadorganismen zu zerstören, abzuschrecken, unschädlich zu machen, Schädigungen durch sie zu verhindern oder sie in anderer Weise zu bekämpfen.“ 3.2 Wirkstoff Es gilt die Definition von Biozid-Wirkstoff gemäß Biozidrichtlinie: „Stoffe oder Mikroorganismen einschließlich Viren oder Pilze mit allgemeiner oder spezifischer Wirkung auf oder gegen Schadorganismen.“
3.3 Desinfektionsmittel Produkt oder Wirkstoff (3.1 und 3.2).
3.4 Testorganismen
Die für die Durchführung in dieser Prüfvorschrift verwendeten Bakterien und Bakteriophagen (Viren).
3.5 Kontaktzeit Einwirkzeit des Desinfektionsmittels auf den Testorganismus.
4 Anforderungen
Die erhobenen Anforderungen gelten nur in Verbindung mit dem im Abschnitt 5 zugrundeliegenden Prüfverfahren.
4.1 Bakterizide Anforderungen
Ein Wirkstoff oder Produkt kann für den Einsatz im Trinkwasser als ausreichend bakterizid wirksam bezeichnet werden, wenn folgende Kriterien erfüllt sind:
Fähigkeit eines Produktes oder Wirkstoffs eine Verminderung der Konzentration lebender, vegetativer Bakterienzellen der Referenzstämme Eschericha coli und Enterococcus faecium (5.2.1) unter den in dieser Prüfvorschrift festgelegten Bedingungen um mindestens 2 log10-Stufen nach 10 Minuten und 4 Log10-Stufen nach 25 Minuten Kontaktzeit zu erreichen. Referenzstämme Reduktion | Kontaktzeit Reduktion | Kontaktzeit Eschericha coli 2 Log10-Stufen | 10 Minuten 4 Log10-Stufen | 25 Minuten Enterococcus faecium 2 Log10-Stufen | 10 Minuten 4 Log10-Stufen | 25 Minuten
4.2 Viruzide Anforderungen
Ein Wirkstoff oder Produkt kann für den Einsatz im Trinkwasser als ausreichend viruzid wirksam bezeichnet werden, wenn folgende Kriterien erfüllt sind: Fähigkeit eines Produktes oder Wirkstoffs eine Verminderung der Konzentration der Bakteriophagen (Viren) der Referenzstämme MS2 und PRD1 (5.2.1) unter den in dieser Prüfvorschrift festgelegten Bedingungen um mindestens 2 log10-Stufen nach 10 Minuten und 4 Log10-Stufen nach 25 Minuten Kontaktzeit zu erreichen. Referenzstämme Reduktion | Kontaktzeit Reduktion | Kontaktzeit Bakteriophage MS2 2 Log10-Stufen | 10 Minuten 4 Log10-Stufen | 25 Minuten Bakteriophage PRD1 2 Log10-Stufen | 10 Minuten 4 Log10-Stufen | 25 Minuten
5 Prüfverfahren
5.1 Prinzip
Einem mit Testwasser durchströmten Rohr werden Testorganismen (Bakterien/ Viren) hinzugefügt und deren Konzentration im Testwasser bestimmt. Anschließend wird das zu prüfende Desinfektionsmittel dem Volumenstrom hinzugeführt. Dies markiert den Startzeitpunkt der Desinfektion.
Nach drei definierten Kontaktzeiten von den Testorganismen mit dem Desinfektionsmittel werden Proben an dafür vorgesehenen Probenahmehähnen entnommen.
Während der Probenahme wird der Desinfektionsvorgang in der Probe gestoppt und anschließend die Konzentration der Testorganismen bestimmt.
Um die in dieser Prüfvorschrift gegebenen Wirksamkeitsanforderungen an ein Desinfektionsmittel zu erfüllen, muss eine definierte Reduktion der Testorganismen nach 10 und 25 Minuten erreicht werden.
5.2 Materialien und Reagenzien
5.2.1 Prüfkeime
Die bakterizide Wirkung muss unter Verwendung folgender Bakterien und Viren bewertet werden:
a) Escherichia coli A3, erhältlich am Umweltbundesamt1.
b) Enterococcus faecium, erhältlich am Umweltbundesamt1.
c) Bakteriophage MS2 (DSM2 13767)
d) Bakteriophage PRD1 (DSM2 19107)
Falls zusätzliche Stämme verwendet werden, müssen diese, wie auch die Prüfkeime, unter optimalen Wachstumsbedienungen (Temperatur, Atmosphäre) angezüchtet werden. Das genaue Vorgehen ist im Prüfbericht zu dokumentieren.
5.2.2 Wirtsbakterien für Bakteriophagen
Für die Bakteriophagen MS2 und PRD1 wird als Wirtstamm Salmonella Typhimurium WG49 (NCTC3 12484) verwendet.
5.2.3 Kulturmedien und Reagenzien
5.2.3.1 Allgemeines
Im vorliegenden Prüfverfahren wird auf andere Normen verwiesen. Geräte für die Durchführung dieser zusätzlichen Normen sind nicht aufgeführt. Die Reagenzien müssen der Qualität „analysenrein“ entsprechen und/oder für mikrobiologische Zwecke geeignet sein. Für die Herstellung von Kulturmedien können auch Fertigmedien mit gleicher Zusammensetzung verwendet werden, die nach den Anweisungen des Herstellers hergestellt werden.
5.2.3.2 Testwasser
Folgende Bedingungen müssen vom Testwasser erfüllt werden: - Temperatur 15 °C ± 2 °C - pH-Wert 7,5 ± 0,2 - gelöster organischer Kohlenstoff (DOC) 2,0 mg/L ± 0,3 mg/L natürlich im Wasser vorkommender DOC ist zu verwenden. Die Herstellung des Testwassers erfolgt in einem Vorratstank. Es ist auf eine vollständige Durchmischung zu achten.
5.2.3.3 Lactose-Pepton-Bouillon
Das Flüssignährmedium Lactose-Pepton-Bouillon wird für die Anzucht von E. coli verwendet. Pepton aus Casein (Sifin TN 1403) 17,0 g/L Pepton aus Sojamehl (Sifin TN 1419) 3,0 g/L Lactose (Merck 1.07657) 10,0 g/L Natriumchlorid (Merck 1.06404) 5,0 g/L demin. Wasser 1000 ml
Die Substanzen in einem Kolben in demineralisiertem Wasser lösen (mit Magnetrührstäbchen auf einem Magnetrührer), pH-Wert auf 7,2 ± 0,2 bei 25°C einstellen, à 100 ml abfüllen, mit einem Zellstoffstopfen plus Alufolie versehen und 15 min bei 121°C autoklavieren.
5.2.3.4 Glucose-Bouillon Das Flüssignährmedium Pepton-Bouillon wird für die Anzucht von E. faecium verwendet. Pepton aus Casein (Sifin TN 1403) 15,0 g/L Fleischextrakt (Sifin TN 1410) 4,8 g/L D(+)-Glucose (Merck 1.08342) 7,5 g/L Natriumchlorid (Merck 1.06404) 7,5 g/L demin. Wasser 1000 ml Die Substanzen in einem Kolben in demineralisiertem Wasser lösen (mit Magnetrührstäbchen auf einem Magnetrührer), pH-Wert auf 7,2 ± 0,2 bei 25°C einstellen, à 100 ml abfüllen, mit einem Zellstoffstopfen plus Alufolie versehen und 15 min bei 121°C autoklavieren.
5.2.3.5 Caso-Agar “Casein-Soja-Pepton-Agar“ Nachweis und Zählung von Escherichia coli und coliforme Bakterien (Trypton-Soja-Agar, TSA): Casein (tryptisch verdaut) 15g Sojapepton 5g, NaCL 5g Agar (in Puder-oder Flockenform) 15g-25g abhängig von der Gelierstärke, Destilliertes Wasser 1000ml
5.2.3.6 Neutralisationsmedium Als Neutralisationsmedium oder auch (Desinfektions-)Inhibitor wird ein Stoff bezeichnet, der die Wirkung eines Desinfektionsmittels einschließlich entstandener Nebenprodukten stoppt. Um die Messergebnisse nicht zu verfälschen, muss diese Reaktion innerhalb von wenigen Sekunden abgeschlossen sein. Die Inhibierbarkeit eines Desinfektionsmittels zählt zu den Eignungskriterien für Wirkstoffe und Produkte (Anhang C). Beruht die Wirkung auf oxidativ wirkenden Chlorverbindungen, kann Natriumthiosulfat als Inhibitor eingesetzt werden (Anhang D).
5.2.3.7 Chloroform Für die Herstellung der Phagensuspension wird Chloroform (CHCl3), 99 %, M = 119,38 g/mol verwendet (5.4.3).
5.3 Geräte
5.3.1 Allgemeines Im vorliegenden Prüfverfahren wird auf andere Normen verwiesen. Geräte für die Durchführung dieser zusätzlichen Normen sind nicht aufgeführt. Normale Ausstattung eines mikrobiologischen Labors wird vorausgesetzt. Spezielle Geräte und Materialien die für die Anlage zur Prüfung der Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln benötigt werden sind in Anhang A aufgeführt.
5.3.2 Zentrifuge Zentrifuge mit Zentrifugenröhrchen mit einem Volumen von 200 ml und einer Mindestumdrehungszahl von 6000 rpm. Brutschrank auf (44 0,5) °C thermostatisierbar Brutschrank auf (37 2) °C thermostatisierbar Autoklav zu betreiben bei (121 3) °C und (115 3) °C Photometer
5.4 Herstellung der Viren- Bakteriensuspension
5.4.1 Allgemeines Stammkulturen sind gemäß den Anforderungen nach EN12353 aufzubewahren.
5.4.2 Bakteriensuspension
5.4.2.1 E. coli A3 Aus einer bei -80 °C (± 2 °C) eingefrorenen Arbeitskultur wird der E. coli Stamm A3 auf Caso-Agar (5.2.3.5) “Casein-Soja-Pepton-Agar“ fraktioniert ausgestrichen und 8 h ± 1 h bei 36 °C ± 2 °C bebrütet. Die auf dem Agar gewachsene Kultur wird mit einer Impföse geerntet und zur Beimpfung (Volumen einer Impföse) von 100 ml Lactose-Pepton-Bouillon (5.2.3.3) verwendet. Die angeimpfte Kultur wird 20h ± 4 h bei 36 °C ± 2 °C bebrütet und anschließend Zentrifugation (6000 rpm, 15 min). Der Überstand wird nach der Zentrifugation verworfen und mit sterilem Testwasser bei 6000 rpm, 15 min gewaschen. Das gewaschene Pellet wird in 100 ml sterilem Testwasser aufgenommen. Die hergestellte Bakteriensuspension ist bei 4 °C ± 2 °C aufzubewahren und nach spätestens 2 h in das vorbereitete Vorratsgefäß am Prüfstand einzuimpfen (5.5.1).
5.4.2.2 E. faecium Teltow 11 Aus einer eingefrorenen Arbeitskultur wird der E. faecium Stamm Teltow 11 auf Caso-Agar ausgestrichen und 7 ± 2 h bei 36 °C ± 2 °C bebrütet. Die auf dem Agar gewachsene Kultur wird mit einer Impföse geerntet und zur Beimpfung von 100 ml Glucose-Bouillon (5.2.3.4) verwendet. Die Kultur wird 20h ± 4 h bei 36 °C ± 2 °C bebrütet und durch Zentrifugation geerntet (6000 rpm, 15 min). Der Überstand wird nach der Zentrifugation verworfen und mit sterilem Testwasser bei 6000 rpm, 15 min gewaschen. Das gewaschene Pellet wird in 100 ml sterilem Testwasser aufgenommen. Die hergestellte Bakteriensuspension ist bei 4 °C ± 2 °C aufzubewahren und nach spätestens 2 h in das vorbereitete Vorratsgefäß am Prüfstand einzuimpfen (5.5.1).
5.4.2.3 Salmonella thyphimurium Stamm WG49 Die Stamm- und Arbeitskulturen werden nach DIN EN ISO 10705-1 hergestellt.
5.4.3 Bakteriophagensuspension
Zur Herstellung der Test-Bakteriophagensuspension wird der Wirtstamm Salmonella Typhimurium WG49 (15 ± 2) h im Thermoschüttler (80 rpm; (20 ± 4) h; (36 ± 2) °C) kultiviert. Als Flüssigmedium wird TYGB verwendet (5.4.2.3). Es werden 25 ml TYGB in einem 300-ml-Erlenmeyerkolben auf Raumtemperatur vorgewärmt und mit 0,25 ml der (15 ± 2) h beimpft und im Thermoschüttler für 90 min bei (36 ± 2) °C bebrütet. Aus einer Stamm-Phagensuspension werden Phagen hinzugeben, so dass eine Endkonzentration an plaquebildenden Einheiten (pfu) von ca. 106 - 108/ ml erreicht wird. Im Anschluss wird die Suspension 4 bis 5 h bebrütet (s.o.). Anschließend werden 2,5 ml Chloroform (5.2.3.7) unter dem Abzug hinzugegeben und gut eingemischt. Nach dem Verschließen wird der Kolben (15 ± 2) h, mindestens jedoch für 4 h bei (5 ± 3) °C aufbewahrt. Die wässrige Phase wird in ein Röhrchen übertragen und mit 6000 rpm 20 min zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig abpipettiert. Zur Titerbestimmung wird eine dezimale Verdünnungsreihe hergestellt und im Plaquetest (5.5.2.2) untersucht. Das hergestellte Bakteriophagenlysat wird bis zum Versuch bei (5 ± 3) °C bis zu 28 Tage aufbewahrt oder in Portionen von 5 ml in Kryoröhrchen bei (80 ±10) °C eingefroren. Um den Eintrag von gelösten organischen Kohlenstoff DOC, der zu einer erhöhten Zehrung des Desinfektionsmittels führen könnte zu begrenzen, werden nicht mehr als 10 ml der Phagensuspension zugegeben (5.4.3).
5.5 Verfahrensablauf
5.5.1 Vorbereitung der Prüfanlage
a) Der Vorratsbehälter wird mit Testwasser (5.2.3.2) befüllt.
b) Es wird ein Volumenstrom von 400 Liter pro Stunde (± 20 L/h) eingestellt.
c) Die Aufenthaltszeit des Testwassers ist wie folgt konstant einzustellen:
i. Probenahmehahn 1 = 25 s ± 10 s (Validierungsmesswert, 5.7.1)
ii. Probenahmehahn 2 = 10 min ± 30 s (Prüfwert 1) iii. Probenahmehahn 3 = 25 min ± 60 s (Prüfwert 2) Die Bestimmung der Aufenthaltszeit des Testwassers im Desinfektionsmittelprüfstand ist in Anhang B beschrieben.
d) Die Testorganismen werden wie in Kapitel 5.4 beschrieben hergestellt und in den Vorlagebehälter des Prüfstandes gegeben. Es werden zunächst die Bakteriensuspensionen (E. coli, Enterococcus faecium) zusammen mit dem Bakteriophagen MS2 vorgelegt. Die Untersuchung für den Test-Bakteriophagen PRD1 erfolgt in einem separaten Versuchsansatz. Im Vorratsbehälter der Keimsuspension muss die Konzentration der Bakteriophagen (1 x 109 - 1 x 1011) pfu /100 ml und der Bakterien (1 x 108 - 5 x 109) KBE/ 100 ml liegen. Die Testorganismen werden in einem Verhältnis1:1000 dem Testwasser zugeführt, so dass in der Anlage (Hahn 0) die Konzentration (1 x 105 - 5 x 106) KBE/ 100 ml bzw. (1 x 106 - 1 x 108) pfu /100 ml beträgt.
e) Die gewünschte Desinfektionsmittelkonzentration wird zudosiert. Am Prüfstand müssen für einen Zeitraum von mindestens 60 min die geforderten physiko-chemischenParametern eingehalten werden, bevor eine Probenahme erfolgen kann.
f) In die sterilen Probenahmegefäße wird der Inhibitor für das Desinfektionsmittel (5.2.3.6) vorgelegt.
5.5.2 Prüfverfahren zur Festlegung der bakteriziden und viroziden Wirkung eines Wirkstoffs oder Produktes Beginnend bei Probenahmehahn 3 bis Hahn 0 (Anhang A) wird ein 50-ml-Probenahmegefäß unter den Hahn gehalten und unter Schwenken bis etwa zur 50-ml-Markierung befüllt. Das Schwenken soll eine gute Verteilung des Inhibitors (Neutralisationsmittel) in der Probe gewährleisten. Direkt nach Befüllen der Röhrchen werden diese zügig fest verschlossen, zwei- bis dreimal kräftig geschüttelt und umgehend auf einen schnellen Mischer (Strudelbildung) gestellt. Auf eine gute Durchmischung der Probe mit dem Inhibitor ist zu achten (tiefe Strudelbildung). Anschließend wird die Probe ein zweites Mal kräftig geschüttelt. Werden größere Probenvolumina benötigt, wird eine 1-L-Glasflasche unter den entsprechenden Hahn gehalten und unter Schwenken befüllt. Die 1-L-Glasflasche nicht vollständig befüllen, sondern ein größeres Luftvolumen frei lassen. Nach den Probenahmen wird die Flasche sofort verschlossen und kräftig geschüttelt. Die Proben werden bis zur Analyse im Kühlschrank bei (5 ± 3) °C aufbewahrt. Nach jeder mikrobiologischen Beprobung der Hähne 1 – 3 wird unmittelbar die Konzentration des Desinfektionsmittels gemessen, sodass man über die Zeit die Zehrung eines Desinfektionsmittels ablesen kann. Die Konzentration des Desinfektionsmittels zum Zeitpunkt Null wird aus der Konzentration des Vorlagebehälters und dem sich im Testwasservolumenstrom ergebenden Verdünnungsfaktor berechnet. Vor den Probenahmen muss von jedem Probenahmehahn der Durchfluss bestimmt werden. Anhand der Durchflussmessung ist die genaue Kontaktzeit zwischen Testorganismen und Desinfektionsmittel unter Berücksichtigung des Korrekturfaktors (siehe Anhang B) zu berechnen. Liegen die Kontaktzeiten außerhalb der Vorgaben (5.5.1c) muss der Durchfluss entsprechend angepasst werden. Es werden 3 wiederholende Probenahmen in einem Abstand von 30 bis 60 min durchgeführt.
5.5.2.1 Kontrolle der Neutralisation des Desinfektionsmittels Für jeden Versuch wird ein zusätzliches Probenahmegefäß mit Neutralisationsmedium (Inhibietor) vorbereitetet und an Hahn 1 eine Probe entnommen. Die Probe wird auf reaktive Rückstände des Desinfektionsmittels überprüft. Es darf kein Desinfektionsmittel nachgewiesen werden, da ansonsten das Neutralisationsmedium nicht vollständig gewirkt hat. Nur im Fall einer vollständigen und schnellen Neutralisation des Desinfektionsmittels kann die Reduktion der Testorganismen über die Zeit genau bestimmt werden.
5.5.2.2 Analyse der mikrobiologischen Proben Die Proben (5.5.2), die an den einzelnen Hähnen genommen wurden und die eine Reduktion der Testorganismen anzeigen, werden möglichst umgehend, spätestens aber nach 4 h auf die bakteriologischen und spätestens nach 36 h für die virologischen Parameter untersucht. Die Proben müssen kühl (5 ± 3) °C gelagert werden.
Folgende Nachweisverfahren sind für die Testorganismen anzuwenden:
a) E. coli A3 (DIN EN ISO 9308-1 und -3)
b) E. faecium Teltow 11 (DIN EN ISO 7899-1 und -2)
c) MS2 (DIN EN ISO 10705-1:2001)
d) PRD1 (DIN EN ISO 10705–2:2001) Je nach zu erwartender Konzentration werden für den Nachweis der Testbakterien die Membranfiltrationsverfahren (DIN EN ISO 9308-1 oder DIN EN ISO 7899-2) oder die MPNVerfahren (DIN EN ISO 9308-3 oder DIN EN ISO 7899-1) mit entsprechenden Verdünnungsstufen eingesetzt. Bei der Membranfiltration werden mindestens zwei Platten pro Probe angesetzt.
5.6 Berechnung und Darstellung der Ergebnisse
5.6.1 Berechnung der Bakterienkonzentration Bei den MPN-Verfahren wird das Ergebnis direkt als MPN/ml oder MPN/100 ml erhalten. Die Berechnung der Ergebnisse bei Membranfiltrationsverfahren erfolgt nach DIN EN ISO 8199 in KBE/ 100 ml.
5.6.2 Berechnung der Bakteriophagenkonzentration Sofern vorhanden, Platten mit vorzugsweise mehr als 30 gut voneinander getrennten Plaques auswählen. Wenn die Anzahl stets unter 30 je Platte beträgt, solche Platten auswählen, die mit dem größten Probenvolumen beimpft wurden. Platten unter 10 Plaques je Platte können nicht für eine quantitative Bestimmung verwendet werden. Anhand der Anzahl der gezählten Plaques die Anzahl X der Plaque-bildenden Einheiten somatischer Coliphagen in 1 ml der Probe wie folgt berechnen: ( ) ( ) n1 V1F1 n2V2 F2 N X X die Anzahl Plaque-bildender Einheiten somatischer Phagen je Milliliter (pfu/ml) N die Gesamtanzahl von gezählten Plaques aller Platten n1,n2 die Anzahl der Parallelbestimmungen, bezogen auf jede Verdünnung F1,F2; V1,V2 die im Test eingesetzten Probenvolumen in Millilitern, bezogen auf F1,F2; F1,F2 der Verdünnungs-(oder Konzentrations-)faktor, bezogen auf V1,V2 (F = 1 für eine unverdünnte Probe, F = 0,1 für eine zehnfache Verdünnung, F = 10 für eine zehnfache Konzentration usw.). Wenn nur eine Verdünnung/Konzentration ausgezählt wird, vereinfacht sich die Formel zu: nVF N X Beispiel: Eine Probe wurde unverdünnt und 1:10 verdünnt mit je zwei Parallelen untersucht. Die Auszählung ergab:
Verdünnung Ergebnis pfu unverdünnt 98; 91 -1 10; 5 Berechnung des Ergebnisses: N = 98 + 91 + 10 + 5 = 204 Probemenge V1 = 1 ml, Anzahl der Parallelbestimmungen n1 = 2, Faktor F1 = 1, weil unverdünnt, Probemenge V2 = 1 ml, Anzahl der Parallelbestimmungen n2 = 2, Faktor F2 = 0,1, weil 1:10 verdünnt, (2 1 1) (2 1 0,1) 204 X Ergebnis: 93 pfu/ml oder 9,3 · 102 / 100 ml
5.6.3 Angabe der Ergebnisse
Die Ergebnisse der mikrobiologischen Messungen müssen tabellarisch und grafisch dargestellt werden. Die grafische Darstellung umfasst die Ergebnisse der einzelnen Messreihen und den Mittelwert in Abhängigkeit von der Kontaktzeit (Anhang E). Die Nachweisgrenze ist anzugeben. Angaben in der Einheit pfu je 100 ml bzw. KBE je 100 ml. Die Konzentrationsbestimmungen des Desinfektionsmittels an den Hähnen 1 bis 3 sind tabellarisch in mg/L anzugeben. Zusätzlich ist die Konzentration im Vorratsbehälter des Desinfektionsmittels und die berechnete Konzentration im Volumenstrom in mg/L anzugeben. Die Messdaten der Durchflussmessung und die genauen Kontaktzeiten (nach Korrektur) sind anzugeben (Anhang B).
5.7 Auswertung Werden bei der Anwendung des vorliegenden Prüfverfahrens die in Kapitel 4 definierten Anforderungen erfüllt, kann von einer prinzipiell ausreichenden Wirkung des Desinfektionsmittels in der eingesetzten Konzentration ausgegangen werden. Werden bei der Anwendung des vorliegenden Prüfverfahrens die in Kapitel 4 definierten Anforderungen nicht erfüllt, ist das Desinfektionsmittels in der eingesetzten Konzentration nicht zur Trinkwasserdesinfektion geeignet. Da die Referenzkonzentration4, die aus diesem Prüfverfahren resultiert, festgelegten experimentellen Bedingungen entspricht, muss das Desinfektionsmittel in Wässern mit anderen physiko-chemischen Eigenschaften (pH-Wert, DOC, Temperatur) ggf. in seiner Konzentration angepasst werden. Für den Einsatz des Desinfektionsmittels unter besonderen Bedingungen, die stark von den Testbedingungen abweichen (chemische Zusammensetzung des Testwassers, Wassertemperatur) können zusätzliche Prüfbedingungen benötigt werden, um eine abschließende Schlussfolgerung über eine ausreichende Wirksamkeit ziehen zu können.
5.7.1 Validierungsmesswert Der Validierungsmesswert liefert zusätzliche Informationen über die Geschwindigkeit in der ein Wirkstoff oder Produkt seine Wirkung erzielt (5.5.1c). Er wird durch eine Probe am Hahn 1 nach einer Kontaktzeit mit dem Desinfektionsmittel nach 25 s ± 10 s gemessen. Eine sehr große Wirksamkeit im Prüfverfahren zu diesem Zeitpunkt, deutet auf eine möglicherweise zu hohe eingesetzte Konzentration hin. Auch können Messfehler und Messunsicherheiten genauer betrachtet werden.
5.8 Prüfbericht
Der Prüfbericht muss auf diese Prüfvorschrift verweisen. Der Prüfbericht muss mindestens folgende Angaben enthalten:
a) Identität des Prüflaboratoriums und des Auftraggebers
b) Identifizierung der durchgeführten Prüfung:
1. Produktbezeichnung, Wirkstoffbezeichnung
2. Chargennummer und Endverbrauchsdatum (falls vorhanden)
3. Hersteller / Lieferant Anlieferungsdatum (falls vorhanden)
4. Lagerbedingungen
5. vom Hersteller empfohlenes Verdünnungsmittel für die Anwendung des Produkts
6. Wirksubstanz und deren Konzentration;
c) Untersuchungsbedingungen:
1. Datum (Daten) der Prüfung (Analysenzeitraum)
2. physiko-chemische Angaben über das Testwasser (5.2.3.2)
3. Wirkstoff- oder Produktkonzentration
4. die Bildung jeglicher Ausfällungen oder Ausflockungen wird dokumentiert
5. Bebrütungstemperatur
6. Verwendetes Neutralisationsmedium / Inhibitor (5.2.3.6)
7. Identität der zusätzlich verwendeter Bakterien- und Virusstämme, zusammen mit den verwendeten Verfahren für die Anzucht.
d) Prüfergebnisse:
1. Es sind alle Ergebnisse, die in Kapitel 5.6.3 aufgeführt werden, anzugeben
2. Referenzkonzentration
3. Bewertung der bakteriziden und viroziden Wirkung
4. Anzahl der Wiederholungen je Testorganismus
5. besondere Bemerkungen 6. Schlussfolgerung
7. Ort, Datum, Unterschrift.
Escherichia Coli A3
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